PCR test na humani papiloma virus


Detekcija prisustva HPV DNK u ćelijama grlića materice

Prema Svetskoj Zdravstvenoj Organizaciji (WHO), cervikalni karcinom je, posle karcinoma dojke, drugi najveći uzročnik smrtnosti od malignih tumora kod žena, sa približno 300 000 smrtnih ishoda bolesti u svetu godišnje. Svake godine preko 500 000 žena (od čega skoro 80% iz zemalja u razvoju) otkrije da boluje od ove maligne bolesti. Skoro svi cervikalni karcinomi (99.8%) su uzrokovani prisustvom jednog seksualno-prenosivog tumorskog DNK virusa, nazvanog humani papiloma virus (HPV). Tokom protekle decenije, mnogi objavljeni radovi su pokazali da je glavni uzrok razvića cervikalne intraepitelijalne neoplazije kao prekursora cervikalnog karcinoma postojana infekcija specifičnim tipovima HPV. Epidemiološke studije su otkrile da prevalencija HPV infekcije kod seksualno aktivnih žena može da se kreće od 18 do 25%, pogotovo u populacijama seksualno aktivnih tinejdžera. U svakom slučaju, ove žene mogu preneti HPV svojim partnerima ili deci. Kod novorođenčadi, infekcija HPV može dovesti do papiloma usne šupljine i gornjeg respiratornog trakta. Kod HIV bolesnika, HPV infekcija dovodi do ozbiljne i ubrzane progresije bolesti.

Bez redovnih sistematskih pregleda (u svetu se godišnje izvrši oko 160 miliona rutinskih Papanikolau testova), cervikalni karcinom može biti otkriven tek u kasnijim fazama i sa veoma lošom prognozom za obolele žene (smrtni ishod u skoro svim slučajevima). Zbog tako znacajnih negativo-prognostičkih karakteristika, kliničari uvršćuju testiranje na HPV u programe skrininga za cervikalni karcinom. Danas mnoge evropske zemlje prepoznaju važnost HPV skrininga u prevenciji i pokušavaju da implementiraju najnovije HPV molekularne testove u svoj program kao jednu od smernica u borbi protiv cervikalnog karcinoma kod žena.

Komercijalizacijom Roche®-ovog AMPLICOR HPV testa u Evropi od aprila 2004. godine, kliničari i laboratorijski analitičari pokušavaju da uvedu u svoju rutinu ovaj novi test.

AMPLICOR HPV je prvi in vitro kvalitativni dijagnostički test za detekciju humanog papiloma virusa pomocu PCR metode. Test može da identifikuje svih 13 visoko rizičnih genotipova HPV u uzorku cervikalnih ćelija (genotipovi: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68).

Uzimanje, transport i čuvanje uzoraka

Uzimanje uzoraka za AMPLIKOR HPV test može da se uradi na dva nacina, koristeci dva medijuma koja su do sada potvrđena za rad sa ovim testom. To su tečni citološki medijumi (LBC):

Slediti data uputstva proizvođača za uzimanje uzoraka cervikalnih celija u PreservCyt i SurePath medijumu.

Uzimanje uzorka pomocu ThinPrep PreservCyt® medijuma

Uzorci cervikalnih ćelija za AMPLICOR HPV test se uzimaju posebno predvidenim kompletom koji sadrži četkice za uzimanje cervikalnog brisa Cervex-Brush® (Rovers Medical Devices, Art. No. 70671-001) i posude sa tečnim citološkim medijumom PreservCyt® (Cytyc Corporation, ThinPrep bocica za tecnost). Kompletan pribor za uzimanje brisa za PCR test na humani papiloma virus (videti sliku ispod) može se dobiti u našoj laboratoriji.

Na slici su prikazani ThinPrep bočica sa PreservCyt® medijumom i Cervex-Brush® četkica za uzimanje brisa.

Uzimanje uzoraka cervikalnog brisa za PCR test na humani papiloma virus pomoću navedenog pribora vrše isključivo lekari ginekolozi ili drugih specijalnosti u svojim ordinacijama.

Cervikalni bris se uzima posebnom četkicom za jednokratnu upotrebu. Središnjim delom četkice (vrhom) ući u cervikalni kanal toliko duboko da kratke resice koje se nalaze sa strane budu potpuno u kontaktu sa ektocerviksom (videti sliku desno). Pritisnuti nežno i okretati četkicu u smeru kazaljke na časovniku 5 puta, nakon toga izvući i odmah preneti u posudu sa medijumom. Desetak puta uroniti četkicu do samog dna i izvaditi napolje. Pritiskati vrh četkice o dno da se resice razdvoje. Na kraju, gurnuti četkicu do dna i trljati o dno i o zid posude okretanjem trudeći se da resice budu razdvojene, kako bi što više uzetog materijala prešlo u medijum. Ne ostavljati četkicu da stoji uronjena u medijum. Jednom upotrebljenu četkicu baciti. Nakon toga, dobro zatvoriti flašicu poklopcem tako da obeležena linija na poklopcu prede liniju označenu na posudi. Na kraju, obeležiti posudu sa uzetim uzorkom, odnosno ispisati na bočici ime i prezime pacijenta i identifikacioni broj.

Uzorci cervikalnih ćelija uzetih u PreservCyt medijumu mogu da se transportuju na temperaturi 2-30°C. Uzorci mogu da se čuvaju na sobnoj temperaturi (do 30°C) i do 21 dan ili do 8 nedelja na 2-8°C.

☢ PAŽNJA! PreservCyt® je prezervacioni antibakterijski rastvor na bazi metanola i služi kao medijum za transportovanje ginekoloških uzoraka (ćelija i DNK). Koristi se samo za in vitro dijagnostiku. Nesme doći u dodir sa spoljašnjim ili unutrašnjim površinama tela. Udisanje isparenja može biti štetno (koristiti adekvatnu ventilaciju). Može izazvati slepilo ili iritaciju kože i dovesti do smrti ukoliko se proguta. Prilikom upotrebe nositi rukavice i zaštitu za oči, a nakon korišćenja ruke temeljno oprati. Ne koristiti oštećenu ili otpečaćenu posudu. Ne koristutu drvene ili druge neplastične aplikatore. Ne ostavljati četkicu za uzorkovanje naslonjenu na posudu ili uronjenu u rastvor. Pre transporta posudu dobro zatvoriti. Uzorci namenjeni za PCR analizu nesmeju pre toga biti procesuirani na bilo koji način ili za bilo koji drugi test. Upotreba lubrikanata pre uzimanja uzorka može dovesti do neuspeha analize. Cervex-Brush® četkice ne bi trebalo koristiti nakon prvih nedelja trudnoće.

Uzimanje uzorka pomocu SurePath ® medijuma

Uzorci uzeti sa SurePath medijumom moraju da se stave na 2-8°C najkasnije u roku od 8 sati od uzimanja uzorka i da se transportuju na toj temperaturi. Uzorci uzeti sa SurePath medijumom mogu da se cuvaju na 2-8°C do dve nedelje.


☢ NAPOMENA:

    ♦ Treba se strogo pridržavati uputstva za uzimanje i transport uzoraka cervikalnih celija.
    ♦ Uzorci moraju biti uzeti i poslati za obradu na nacin i u roku koji je dat za svaki tip medijuma.
    Nepravilno uzorkovanje, tretman ili transport može dovesti do inhibicije ili neuspeha PCR analize.
    ♦ Laboratorija ne snosi odgovornost za nepravilno uzete, tretirane ili transportovane uzorke.
    ♦ Sve uzorke tretirati kao potencijalne prenosnike infektivnih agenasa.
    ♦ Transportovanje uzoraka cervikalnih celija mora biti pažlivo i u saglasnosti sa važecim propisima za transport etioloških materija. Odlaganje otpada mora biti u saglasnosti sa važecim propisima za odlaganje etioloških i toksicnih materija.




Pripremio: Dimitar Jakimov, specijalista medicinske genetike; oktobar 2005.